L-甲硫氨酸是一種重要的含硫氨基酸，廣泛應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥以及化妝品等領(lǐng)域，年需求量超過200萬噸。目前，甲硫氨酸主要通過化學(xué)合成的方法進行生產(chǎn)。隨著能源和環(huán)境危機的日益嚴峻，利用環(huán)境友好的微生物發(fā)酵法合成L-甲硫氨酸的研究越來越受到關(guān)注。O-乙酰高絲氨酸(OAH)是L-甲硫氨酸合成的重要前體，能夠在乙酰高絲氨酸巰解酶的作用下直接與甲硫醇反應(yīng)生成L-甲硫氨酸?；谏鲜龉に嚶肪€，一種偶聯(lián)發(fā)酵-酶轉(zhuǎn)化的工藝路線已被開發(fā)應(yīng)用于L-甲硫氨酸的工業(yè)生產(chǎn)中，并具有較高的產(chǎn)率。在該工藝中，通過發(fā)酵法合成OAH是制約L-甲硫氨酸生產(chǎn)和降低成本的關(guān)鍵因素之一。此外，OAH還可用于其他高附加值產(chǎn)品如丁內(nèi)酯等的生產(chǎn)，是一種有前途的平臺化學(xué)品。
　　中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員劉君帶領(lǐng)的微生物生理和代謝工程研究組和研究員江會鋒帶領(lǐng)的新酶設(shè)計與酵母基因組工程研究組進行合作，通過結(jié)合代謝工程和蛋白質(zhì)工程的方法，系統(tǒng)地改造大腸桿菌，實現(xiàn)了OAH的高效合成。在研究中，首先比較了兩種不同來源的高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(MetX)，然后通過敲除競爭和消耗途徑基因(metA，metB和thrB)并過表達合成途徑基因(thrA，metxlm)，實現(xiàn)了OAH的積累，其產(chǎn)量達到1.68 g/L。為了進一步提高OAH的生產(chǎn)，該研究采用多種代謝工程策略對工程菌株進行進一步改造，包括：敲除賴氨酸競爭途徑基因lysA；利用啟動子工程調(diào)控ppc表達以增強草酰乙酸的供給；比較不同來源的天冬氨酸激酶，促進前體天冬氨酸的合成等，使OAH的產(chǎn)量提高至4.69 g/L。然而，中間代謝產(chǎn)物高絲氨酸的大量積累說明其下游途徑關(guān)鍵酶MetXlm的催化能力是不足的。為了解決這一問題，該研究分別采用基于進化保守性和基于結(jié)構(gòu)信息的蛋白質(zhì)工程策略對MetXlm進行改造，獲得的突變體酶活比野生型提高了12.15倍并受到更少的反饋抑制。通過優(yōu)化表達MetXlm突變體，使工程菌株OAH產(chǎn)量達到7.37 g/L。隨后該研究通過過表達胞內(nèi)乙酰CoA合成途徑，調(diào)控胞內(nèi)NADPH的合成，進一步提高OAH的合成能力。最終獲得的工程菌株OAH-7在7.5 L發(fā)酵罐中經(jīng)60 h發(fā)酵能夠生產(chǎn)62.7 g/L的OAH，是目前報道的最高水平。
　　該研究獲得國家自然科學(xué)基金、天津市自然科學(xué)基金的支持，相關(guān)研究結(jié)果已發(fā)表于ACS Synthetic Biology 雜志。天津工生所博士生魏亮為論文第一作者，劉君和江會鋒為論文的共同通訊作者。
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代謝改造谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸策略示意圖