7月4日，《自然-方法》（Nature Methods）在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心陳玲玲研究組關(guān)于CRISPR-dCas12a應(yīng)用于DNA活細(xì)胞標(biāo)記的研究成果（CRISPR array-mediated imaging of non-repetitive and multiplex genomic loci in living cells）。該研究篩選并優(yōu)化了現(xiàn)有的CRISPR-dCas12a系統(tǒng)，構(gòu)建了可用于非重復(fù)序列DNA活細(xì)胞成像的CRISPRdelight系統(tǒng)；進(jìn)而利用CRISPRdelight系統(tǒng)揭示了基因位點(diǎn)在細(xì)胞核內(nèi)的定位與其運(yùn)動(dòng)能力和轉(zhuǎn)錄活性的相關(guān)性；利用RNA適配體修飾的CRISPR串聯(lián)序列實(shí)現(xiàn)了對(duì)4種衛(wèi)星DNA的活細(xì)胞多色成像。前期，陳玲玲研究組構(gòu)建了基于CRISPR-dCas13的RNA標(biāo)記系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞和斑馬魚胚胎內(nèi)RNA的成像追蹤以及活細(xì)胞RNA多色成像。此外，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過改造的靶向DNA的CRISPR-Cas9系統(tǒng)可用于活細(xì)胞DNA成像標(biāo)記。這些CRISPR系統(tǒng)在標(biāo)記內(nèi)源核酸序列方面具有優(yōu)勢(shì)，而對(duì)于非重復(fù)DNA/RNA序列的活細(xì)胞特異性成像卻存在較多限制。CRISPR-Cas12a系統(tǒng)屬于類型V的CRISPR-Cas家族，在靶向DNA的同時(shí)具備將CRISPR串聯(lián)序列加工成多條成熟crRNA的能力。因此，CRISPR-Cas12a系統(tǒng)理論上可以通過CRISPR串聯(lián)序列在同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)足夠數(shù)量的crRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)非重復(fù)序列DNA的標(biāo)記。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，該研究選取了三種已報(bào)道的能夠提高基因編輯效率的dLbCas12a突變體，并比較了它們?cè)跇?biāo)記微衛(wèi)星DNA Sat I和Sat III方面的能力。結(jié)果顯示，hyperdLbCas12a突變體可以實(shí)現(xiàn)更高的標(biāo)記效率和信號(hào)質(zhì)量。進(jìn)一步，研究發(fā)現(xiàn)，hyperdLbCas12a可以加工CRISPR串聯(lián)序列，并維持與直接表達(dá)成熟crRNA近似的DNA標(biāo)記能力。同時(shí)，該研究篩選出能夠表達(dá)長(zhǎng)達(dá)50次crRNA重復(fù)序列的CAG啟動(dòng)子，并基于此構(gòu)建了用于活細(xì)胞DNA成像的CRISPRdelight系統(tǒng)。該研究針對(duì)CCAT1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游10kb的區(qū)域設(shè)計(jì)了48條gRNA，使用CRISPRdelight系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了CCAT1基因位點(diǎn)的活細(xì)胞標(biāo)記。以同樣的方式，CRISPRdelight系統(tǒng)在其他6個(gè)非重復(fù)序列基因位點(diǎn)均得到有效驗(yàn)證。同時(shí)，該系統(tǒng)在HCT116、U2OS以及小鼠胚胎干細(xì)胞中同樣有效。研究發(fā)現(xiàn)，相較于之前報(bào)道的基于CRISPR-dCas9的CARGO活細(xì)胞標(biāo)記系統(tǒng)，CRISPRdelight系統(tǒng)具有質(zhì)粒構(gòu)建成本低、周期短、可表達(dá)gRNA數(shù)量多、標(biāo)記系統(tǒng)組成更簡(jiǎn)潔等優(yōu)點(diǎn)。進(jìn)一步，該研究利用CRISPRdelight系統(tǒng)分析了CCAT1在細(xì)胞核內(nèi)的分布特點(diǎn)和運(yùn)動(dòng)特征。研究發(fā)現(xiàn)，位于細(xì)胞核膜處Lamin蛋白層的CCAT1位點(diǎn)運(yùn)動(dòng)能力弱于位于細(xì)胞核內(nèi)的CCAT1位點(diǎn)；進(jìn)而檢測(cè)CCAT1的內(nèi)含子表達(dá)信號(hào)發(fā)現(xiàn)，Lamin蛋白層的CCAT1位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄活性更弱。同時(shí)，研究對(duì)HSPH1、HSPA1A等熱休克基因進(jìn)行標(biāo)記，并在向細(xì)胞施加42°C或亞砷酸鈉刺激后發(fā)現(xiàn)，定位于核斑的HSPH1基因位點(diǎn)會(huì)增多，且位于核斑的基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄活性會(huì)更強(qiáng)。這表明了基因組DNA的細(xì)胞核內(nèi)空間位置與其運(yùn)動(dòng)能力和表達(dá)活性的相關(guān)性。該工作通過RNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化，將BoxB、Pepper、PP7和MS2等RNA適配子元件插入到gRNA中，利用CRISPRdelight系統(tǒng)和這些元件對(duì)應(yīng)的融合熒光蛋白，實(shí)現(xiàn)了微衛(wèi)星DNA Sat I、Sat II、Sat III和Sat α的活細(xì)胞四色標(biāo)記。CRISPRdelight系統(tǒng)為探討活細(xì)胞中DNA位點(diǎn)的空間位置和動(dòng)力學(xué)特征，提供了更簡(jiǎn)單和便利的新手段。研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、科學(xué)技術(shù)部、中國(guó)科學(xué)院和上海市的資助，并獲得分子細(xì)胞卓越中心細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)的技術(shù)支持。論文鏈接分子細(xì)胞卓越中心開發(fā)出CRISPRdelight活細(xì)胞DNA成像新工具