近日，中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所研究員張長(zhǎng)生團(tuán)隊(duì)和廈門(mén)大學(xué)教授王斌舉團(tuán)隊(duì)合作，在細(xì)胞色素P450酶催化糖肽分子內(nèi)苯酚偶聯(lián)反應(yīng)的機(jī)制研究中取得進(jìn)展。相關(guān)研究成果以Discovery and Biosynthesis of Cihanmycins Reveal Cytochrome P450-Catalyzed Intramolecular C?O Phenol Coupling Reactions為題，發(fā)表在《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》（JACS）上。

在化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，細(xì)胞色素P450酶因獨(dú)特、多樣的催化能力而備受關(guān)注。P450酶催化的分子內(nèi)C?O和C?C苯酚偶聯(lián)反應(yīng)在天然產(chǎn)物生物合成中扮演著關(guān)鍵角色，廣泛存在于糖肽類(lèi)抗生素中。雖然糖肽類(lèi)抗生素中多個(gè)催化分子內(nèi)苯酚偶聯(lián)反應(yīng)P450酶的功能和晶體結(jié)構(gòu)相繼被解析，但底物復(fù)合物結(jié)構(gòu)的缺失導(dǎo)致該類(lèi)反應(yīng)的催化機(jī)制是未解之謎。

該研究在放線菌Amycolatopsis cihanbeyliensis DSM 45679中發(fā)現(xiàn)了C?O連接的新型雙環(huán)糖肽類(lèi)化合物cihanmycins（CHMs）。CHM A (1)的結(jié)構(gòu)通過(guò)X-ray單晶衍射確定為雙環(huán)糖肽，包含肉桂?；鶊F(tuán)和兩個(gè)稀有的D-阿拉伯呋喃糖。研究基于生物信息學(xué)分析和異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)，在DSM 45679的基因組中定位了CHM的基因簇，并通過(guò)體內(nèi)基因敲除和體外生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了3個(gè)P450酶的功能，也就是Cih26負(fù)責(zé)肉桂?；鶊F(tuán)的環(huán)氧化和羥化，Cih32負(fù)責(zé)三個(gè)氨基酸的羥化，Cih33及其同源蛋白DmlH和EpcH催化分子內(nèi)C?O苯酚偶聯(lián)反應(yīng)形成CHM的雙環(huán)骨架。

為揭示Cih33及其同源蛋白催化C?O苯酚偶聯(lián)反應(yīng)的機(jī)制，該團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了晶體學(xué)研究并解析了DmlH和DmlH?7復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，揭開(kāi)了分子內(nèi)C?O苯酚偶聯(lián)P450酶與大環(huán)肽結(jié)合模式的神秘面紗。同時(shí)，單環(huán)底物7的柔性結(jié)構(gòu)使其N(xiāo)MR信號(hào)裂分復(fù)雜，難以解析結(jié)構(gòu)，而DmlH?7的結(jié)構(gòu)獲取提供了通過(guò)復(fù)合物晶體鑒定小分子結(jié)構(gòu)的案例。底物7與DmlH的輔因子血紅素平面之間有一個(gè)水分子，可能在苯酚偶聯(lián)反應(yīng)的攫氫過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。為驗(yàn)證這一推測(cè)，該研究開(kāi)展了分子動(dòng)力學(xué)模擬和量子力學(xué)/分子力學(xué)計(jì)算，揭示了DmlH催化分子內(nèi)苯酚偶聯(lián)反應(yīng)由水介導(dǎo)的雙自由基機(jī)制，提出了水分子在雙自由基苯酚偶聯(lián)反應(yīng)中的重要作用。

此外，基于生信分析，科研人員在數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘到81個(gè)含有Cih33同源蛋白的肽類(lèi)基因簇。該團(tuán)隊(duì)對(duì)這些基因簇的P450酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)催化分子內(nèi)苯酚偶聯(lián)反應(yīng)的Cih33/DmlH/EpcH和糖肽類(lèi)抗生素的P450酶均聚集在同一分支，表明該分支中的其他P450酶可能具有相似的功能和機(jī)制，而編碼這些P450酶的基因簇有望產(chǎn)生新穎的雙環(huán)肽類(lèi)化合物。

該研究證實(shí)了雙環(huán)糖肽類(lèi)化合物CHM生物合成中3個(gè)P450酶的功能，并利用酶學(xué)和計(jì)算化學(xué)等方法揭示了DmlH催化分子內(nèi)苯酚偶聯(lián)反應(yīng)由水介導(dǎo)的雙自由基機(jī)制，為探討P450酶催化的分子內(nèi)苯酚偶聯(lián)反應(yīng)提供了新視角，并為發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)更多新穎的雙環(huán)肽類(lèi)化合物奠定了研究基礎(chǔ)，為抗生素研發(fā)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

研究工作得國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“合成生物學(xué)”重點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)、國(guó)家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目、中國(guó)科學(xué)院王寬誠(chéng)率先人才計(jì)劃、廣東省自然科學(xué)基金等的支持。

論文鏈接

CHM生物合成中3個(gè)P450酶的功能